青岛大学附属医院刘敏教授团队发表抗原诱导自身免疫性重症肌无力模型研究成果
探究使用大鼠乙酰胆碱受体(AChR)α亚基77-96肽段抗原(R77-96)制备实验 性自身免疫性重症肌无力(EAMG)小鼠模型的可行性。将42 只无特定病原体(SPF)级 C57BL/6小鼠按照体质量匹配原则分为对照组(n=10)、R97-116造模组(n=16)和R77-96造模组 (n=16),其中R97-116为AChR α亚基97-116肽段。于第1、14、35天,3组小鼠分别注射PBS (200 μL)、R97-116(0.1 mg/10 g)、R77-96(0.1 mg/10 g)。采用Lennon评分评估小鼠肌无力严重程 度,四肢抓力参数测评小鼠四肢力量,疲劳转棒实验检测小鼠易疲劳状态,免疫荧光染色观察小鼠腓 肠肌抗AChR-IgG抗体沉积情况,间接ELISA法检测小鼠血清中抗AChR抗体含量。采用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 9软件进行统计分析和作图,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采 用LSD检验。重复测量数据采用广义估计方程分析,进一步两两比较采用Bonferroni法检验。死亡 率数据比较使用Fisher精确检验。(1)Lennon评分结果显示,第77 天,R77-96造模组与 R97-116造模组Lennon评分[1.50(1.00,2.00)分,1.50(1.00,3.75)分]比较差异无统计学意义(P= 1.000),两组Lennon评分均高于对照组[0(0,0)分](均P<0.001)。R77-96造模组第35 天即有小鼠 出现肌无力症状,而R97-116造模组第43 天首次有小鼠出现肌无力症状。(2)四肢抓力参数结果显 示,第77 天 R77-96造模组与R97-116造模组比较差异无统计学意义[7.11(6.59,7.48),7.05(1.63,7.68),P=1.000],两者均低于对照组[9.37(8.90,10.19)](均P<0.001)。(3)疲劳转棒实验显示, 第77 天 R77-96造模组与R97-116造模组比较,小鼠维持时间差异无统计学意义[194.08(177.33,222.56)s,205.84(35.23,240.26)s,P=1.000],两者均低于对照组[267.47(261.62,322.69)s](均P< 0.001)。(4)免疫荧光结果显示,R77-96造模组和R97-116造模组小鼠腓肠肌可见抗AChR-IgG抗体 沉积,对照组中未见沉积,抗AChR-IgG平均荧光强度R77-96造模组与R97-116造模组比较差异无统 计学意义(P=0.124),两者均高于对照组(均P<0.001)。(5)小鼠血清抗AchR抗体浓度结果显示, 血清抗AchR抗体浓度R77-96造模组与R97-116造模组比较差异无统计学意义(P=0.577),两者均 高于对照组(均P<0.001)。R77-96作为免疫原能够成功诱导EAMG小鼠模型,与R97-116造 模成功率无明显差异,且R77-96可能缩短诱导EAMG时间。
重症肌无力是一种发 病机制尚未完全阐明的自身免疫性疾病,建立能 够模拟疾病免疫病理特征的动物模型,对深入研究 该病具有重要意义。目前常用的MG动物模型仍存 在一定局限性:被动转移MG模型不产生内源性 致病抗体所激发的自身免疫反应;经典的实验 性自身免疫性重症肌无力模型,通过分离纯化电鳐 电器官中的乙酰胆碱受体作为抗原来主动免疫动物,不仅来源稀有、价格昂贵且制备流程复杂;基于大鼠乙酰胆 碱受体α亚基97-116肽段抗原(R97-116)诱导的 EAMG模型则存在出现MG症状较慢,整体实验周 期长等问题,因此亟须寻找新的替代方案。 既往研究表明,通过注射重组人源AChR α亚 基1-210肽段和97-116肽段(R97-116)均成功在大 鼠中诱导出EAMG,后者在小鼠中也获得成 功。而人和大鼠的AChR α亚基序列高度相似, 且包含主要免疫原区或其邻近序列。对比大鼠 AChR α亚基中主要免疫原区、R97-116及两者邻近20个氨基酸范围内的序列,发现大鼠AChR α亚基 77-96肽段(R77-96)较R97-116富含多种极性带电 荷氨基酸,这使R77-96具有更强的亲水性,更易 被吸收,从而诱发抗原抗体免疫反应,此外,R77-96 所含有的多种带正电荷氨基酸,也使其更易被主要 组织相容性复合物Ⅱ获取,有利于T细胞的激活, 体现出更高的免疫原性。R77-96具备诱导 EAMG免疫反应产生的有利条件,本团队的预实验 发现使用R77-96作为抗原能诱导小鼠出现明显的 肌无力症状。因此,本研究选取R77-96作为诱导小 鼠MG的免疫原,与R97-116免疫原比较,探寻一种 简单易行,能够精确模拟人MG关键免疫病理特征 的动物模型。
1.实验动物:雌性C57BL/6小鼠,6~8周龄,无 特定病原体(specific pathogen free,SPF)级,购自济 南朋悦实验动物繁育有限公司,饲养于隆科生物 (青岛)有限公司,合格证号:SCXK(鲁)2022-0006,实验室通风良好,相对湿度45%~65%,环境温度 (21±2)℃,12h昼夜更替,定期更换饲料、垫料和 水。 本实验严格遵循实验动物伦理保护规定执行, 并通过青岛大学附属医院医学伦理委员会批准,伦 审批件号:QYFYWZZLL293402. 主要试剂与仪器:R77-96(货号:24070049,杭 州肽佳生物科技有限公司);R97-116(货号: C633MJPKGO-1/ PE9985,金斯瑞生物科技公司);完 全弗氏佐剂(CFA)(货号:HY-153808,德国默克集 团);通用型组织固定液(货号:G1101-500ML,武汉 塞维尔生物科技有限公司);封闭用羊血清(工作 液)(货号:ZLI-9056,北京中杉金桥生物技术有限公 司);免疫染色通透液(TritonX-100)(货号:P0096 100mL,上海碧云天生物技术有限公司);NF-H/ NF200 抗体(18934-1-AP,武汉三鹰生物技术有限公 司);山羊抗小鼠 IgG(H+L)二抗 594(货号: 2445823,赛默飞世尔科技公司);山羊抗兔IgG(H+ L)二抗488(货号:2566328,赛默飞世尔科技公司); 小鼠抗AChR抗体ELISA试剂盒(货号:ml398745, 上海酶联生物科技有限公司)。 大小鼠抓力测定系 统(型号:ZS-ZL,众实科技);大小鼠转棒测试仪(型 号:ZS-RDM,众实科技)。1. 动物分组及 EAMG 模型建立:将 42只 C57BL/6 雌性小鼠按照体质量匹配原则分为3组: 对照组10只、R97-116 造模组16只、R77-96 造模组 16只。 R97-116 造模组和 R77-96 造模组分别以 R97-116 和 R77-96 肽段作为免疫原建立动物模型, 对照组仅注射无菌PBS。 将R97-116 和 R77-96 肽 段分别和无菌PBS配制成0.1mg/μL稀释液,用稀 释液与完全弗氏佐剂(按1 ∶ 1比例)制备抗原乳 剂。 初次注射小鼠时,取每只小鼠200μL抗原乳剂 或无菌PBS 于颈背部皮下注射,初次免疫后第14 天和第35天,再分别注射同剂量抗原乳剂或无菌 PBS1次。 为避免因挣扎而影响药物注射,对小鼠 采用吸入式异氟烷进行麻醉。 使用通用型小动物麻 醉机,以5%异氟烷与纯氧混合气体进行诱导,待小 鼠失去意识后,将其移至手术台,通过鼻锥维持麻 醉,异氟烷浓度调整为1.5%~2.5%以维持手术所 需深度,当小鼠出现以下情况时证明麻醉深度合适: ①翻正反射消失;②角膜反射存在但明显减弱;③ 呼吸频率平稳且规律;④对后肢趾间夹捏等伤害性 刺激无运动反应。2. 行为学评估时间、内容和评估标准:初次注射 后第1~49天,每隔7d 评估1 次,初次注射后第 50~77天,每隔3d 评估1 次。 评估内容:体质量、 Lennon 评分、四肢抓力、疲劳转棒实验(四肢抓力和 疲劳转棒实验间隔4h以上)。 评估均于当日完成。 评估标准依据盛誉妍等[16]所描述的:①Lennon 评 分≥1分;②四肢抓力参数较空白组下降;③疲劳转 棒维持时间较空白组减少;④血清AChR抗体含量较 空白组增加;⑤AChR抗体荧光染色阳性。满足①且、②、③、④、⑤中任意一项,则认为模型制备成功。3. Lennon 评分:对小鼠进行评分前先使小鼠 反复抓握笼顶20~30次(小鼠尾巴底部朝向笼子格 栅,当它的前肢抓住格栅时,慢慢地向后拉过格栅, 这样小鼠将进行一系列抵抗向后的抓握运动),以 模拟疲劳实验的效果。 观察小鼠表现,予以评分:0 分:无明确的肌无力表现;1分:撕咬无力,四肢力量 差,在光滑地面上前肢打滑,活动减少,且易疲劳;2 分:明显无力,在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓 力弱;3分:在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握,濒死状态;4分:死亡。 动物症状在以上4者 之间可分别以0.5、1.5、2.5 计分。4. 四肢抓力参数:将小鼠平放于仪器网格栏上, 尾端正对操作者,待小鼠安静,抓持小鼠尾巴,沿水 平方向快速向后拉扯,使小鼠四肢抓握网格栏,直至 小鼠松抓,记录仪器显示最大值。 每只小鼠分别进 行8次四肢抓力测试,记录其后5次抓力大小,并取 其平均值,死亡小鼠参数记作0。 为排除体质量对 小鼠抓力的影响,每只小鼠称重3次,取平均值,精 确到小数点后1位数。 四肢抓力参数=四肢抓力 (g)÷体质量(g)。5. 疲劳转棒实验:每次评估均进行4次测试,第 1 次为适应性训练,记录后3次实验数据,每次间隔 30min,取3 次数据的平均值,死亡小鼠维持时间记 作0。 实验条件设置:初始速度4圈/min,加速时间 5s,持续时间60s;一级速度40 圈/min,加速时间 300s,持续时间10s;二级速度100 圈/min,加速时 间300s,持续时间1s。 每只小鼠放在不同通道上, 观察小鼠活动,除小鼠跌落转棒外,当出现以下情况 也按跌落处理:小鼠抱紧转棒随转棒一同旋转;小鼠 后肢累计两次以上蹬踩周围隔板。 记录小鼠疲劳转棒维持时间。6. 免疫荧光染色:初次注射78d后,每组随机 选3只小鼠,按0.5mg/10g腹腔注射1%戊巴比妥 钠麻醉小鼠,暴露心脏,使用0.9%NaCl溶液进行灌 注,再用4%多聚甲醛溶液进行灌注后取腓肠肌,脱 水、再固定,行冷冻切片(厚14 μm),未染色切片 20 ℃保存,染色后4 ℃保存。染色:切片经PBS浸 泡30 min,晾干20 min,用羊血清和0.3% Triton X-100封闭60 min,一抗(1 ∶ 400)4 ℃下孵育过夜, PBS洗涤3 次,一次15 min,应用合适的荧光二抗 (1 ∶ 400)常温下避光孵育60 min,PBS洗涤3 次, 一次15 min,抗荧光淬灭剂覆盖,封片。在Eclipse 50i荧光显微镜下观察荧光图像,用Image图像分析 系统进行处理。7.ELISA实验:第78 天取小鼠眶内静脉血 0.2 mL,4 ℃、3 000×g离心15 min后取上层血清。 根据ELISA试剂盒说明书进行操作,在酶标仪波长 450 nm处测定OD值,根据标准曲线,计算抗体浓 度,死亡小鼠不计入统计。8.统计学处理:采用SPSS 26. 0和GraphPad Prism 9软件进行数据统计分析和作图,符合正态分 布的计量资料以x±s表示,不符合正态分布以 M(Q1 ,Q3 )表示,IgG平均荧光强度、抗AChR抗体 含量相关数据多组间比较采用单因素方差分析,进 一步两两比较采用LSD检验。Lennon评分、四肢抓 力参数以及疲劳转棒维持时间相关重复测量数据采 用广义估计方程分析,进一步两两比较采用 Bonferroni法检验。死亡率数据比较使用Fisher精 确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
Lennon评分结果显示,3 组小鼠Lennon评分的 时间和组别交互效应显著(χ2 交互 =665. 108,P< 0.001),时间主效应和组别主效应均显著(χ2 时间 = 265.055, χ2 组别 =82.957,均P<0.001)。初次注射后 第35 天 R77-96造模组出现肌无力症状小鼠,第43 天 R97-116造模组出现肌无力症状小鼠,两组均随 时间进行性加重。至第77 天,R77-96造模组 Lennon评分为1.50(1.00,2.00)分,其中13 只评分 达到1 分以上,3 只死亡;R97-116造模组为1.50 (1.00,3.75)分,其中12 只评分达到1 分以上,4 只 死亡;对照组为0(0,0)分。R77-96和R97-116造模 组评分均高于对照组(均P<0.001),R77-96造模组 与R97-116造模组比较差异无统计学意义(P= 1.000)。R77-96造模组小鼠死亡率为18. 75%, R97-116造模组死亡率为25.00%,两者比较差异无统计学意义(Fisher精确检验显示双侧P=0.529)。 见图1。四肢抓力参数结果显示,3 组小鼠四肢抓力参 数的时间和组别交互效应显著(χ2 交互 =1 199.047,P< 0.001),时间主效应和组别主效应均显著(χ2 时间 = 327.918,χ2 组别 =69.900,均P<0.001)。前21 d 3组 四肢抓力参数发展趋势相似,第28 天 R77-96和 R97-116造模组参数随时间逐渐下降,而对照组指 数随时间逐渐上升。至第77 天,R77-96造模组四 肢抓力参数为7.11(6.59,7.48),R97-116造模组 参数为7. 05(1. 63,7. 68),对照组9. 37(8. 90, 10.19)。R77-96和R97-116造模组四肢抓力参数 均低于对照组(均P<0. 001),R77-96造模组和 R97-116造模组四肢抓力参数比较差异无统计学意义 (P=1.000)。见图2。 三、3 组小鼠疲劳转棒维持时间比较 疲劳转棒实验结果显示,3 组小鼠疲劳转棒维 持时间的时间和组别交互效应显著(χ2 交互 = 2 250.427,P<0.001),时间主效应和组别主效应均 显著(χ2 时间 =219. 566,χ2 组别 =9. 209,P时间 <0. 001, P组别 <0.05)。3 组小鼠维持时间在前42 d随时间 变化趋势基本相似,第49 天,R77-96和R97-116造 模组维持时间均开始随时间进行性下降。至第77 天,R77-96造模组维持时间为194. 08(177. 33, 222.56)s,R97-116造模组时间为205.84(35.23, 240. 26) s,对照组时间为267. 47(261. 62, 322.69)s,R77-96和R97-116造模组时间均低于对照 组(均P<0.001),R77-96造模组与R97-116造模组时间比较差异无统计学意义(P=1.000)。见图3。荧光染色结果显示,3 组小鼠腓肠肌抗AChR IgG抗体平均荧光强度差异有统计学意义(F= 314.242,P<0.001),R77-96造模组抗AChR-IgG抗 体平均荧光强度为205.52±12.43,R97-116造模组 为191.85±7.88,对照组为33.07±6.82。R77-96造 模组和R97-116造模组抗AChR-IgG抗体平均荧光 强度均高于对照组(均P<0.001),R77-96造模组与 R97-116造模组比较差异无统计学意义(P= 0.124)。R77-96造模组和R97-116造模组轴突(神 经丝蛋白)附近存在IgG抗体沉积,对照组该区域无IgG抗体沉积。表明R77-96造模组和R97-116造 模组小鼠体内均产生自身致病性抗体并沉积于轴突 附近,符合EAMG模型的病理表现。见图4、图5。 ELISA结果显示,3 组小鼠血清抗AChR抗体 含量差异有统计学意义(F=18.821,P<0.001)。 R77-96造模组血清抗AChR抗体含量为 (1 898.08±655.44) pmol/L,R97-116造模组AChR 抗体含量为(2 013.97±476.58) pmol/L,对照组 AChR抗体含量为(780. 74±292. 88) pmol/L。 R77-96造模组和R97-116造模组抗AChR抗体含量 均高于对照组(均P<0. 001),R77-96造模组与 R97-116造模组比较抗体含量比较差异无统计学意 义(P=0.577)。见图6。
EAMG小鼠所表现的肌无力症状及神经肌肉接 头处的病理特征与人类MG高度相似,因此该模型 在研究MG发病机制及评估治疗方法方面具有重要 价值。本研究选用R77-96肽段诱导EAMG模 型,通过这种人工合成AChR α亚基部分肽段,可精 确设计抗原表位,从而实现对免疫原性与特异性的 可控性优化。此外,基于化学合成工艺的稳定性优 势,合成肽段在批次一致性和长期储存方面表现出 良好的可行性,可显著降低实验成本并提高建模效 率。目前利用人工合成AChR α亚基部分肽段 已成为更多研究者青睐的方案。 在以往的EAMG研究中,抓力测量通常仅限于 绝对数值的统计,而这种方式并不能准确反映 疾病中小鼠力量变化,因为体质量减轻和肌肉量减少会显著影响小鼠的四肢抓力。为排除这一干扰因 素,本研究参考成人相对握力参数的计算方式, 采用小鼠四肢抓力(g)与体质量(g)的比值,从而得 到标准化后的小鼠四肢相对抓力参数,本实验使用 该方法准确反映了小鼠力量的变化,两造模组与对 照组比较差异显著,提高了检测的准确度和灵敏性。 在本实验终点时,Lennon评分、四肢抓力参数、 疲劳转棒维持时间、抗AChR-IgG抗体平均荧光强 度以及血清中抗AChR抗体水平在R97-116和 R77-96两个造模组均表现出相似的严重程度,表明 R77-96免疫原能够模拟出与R97-116免疫原同等 强度的EAMG模型。但R77-96造模组第35 天即 出现肌无力症状小鼠,而R97-116造模组首次出现肌无力症状在第43 天,且R77-96造模组第65 天和 69 天抓力参数和疲劳转棒维持时间的下降程度稍 大于R97-116造模组的下降程度,表明R77-96 EAMG可能会提供一个更早的研究窗口。 R77-96作为大鼠AChR α亚基77-96肽段抗 原,具有较强的溶解性和免疫原性。R77-96包含多 种极性带电荷氨基酸(极性带电荷氨基酸亲水性远 大于极性不带电荷氨基酸),这些氨基酸使抗原 更易溶于血液,有利吸收,在体内更快产生相应免疫 反应。R77-96较强的免疫原性与主要组织相容性 复合物Ⅱ提呈有关。主要组织相容性复合物Ⅱ与多 肽结合的部分多由带负电荷氨基酸组成,偏好与 带正电荷的碱性氨基酸结合,而R77-96中存在多种 带正电荷碱性氨基酸,更易与主要组织相容性复合 物Ⅱ结合,被提呈给辅助性T细胞,从而激活T细 胞产生相应抗原抗体免疫反应。这可能是R77 96造模组出现症状较早的原因。 实验中部分造模组小鼠虽然表现出高的抗 AChR抗体水平但其Lennon评分并不十分严重,这 种抗体水平高低与相应症状严重程度并不完全一致的现象符合EAMG抗体-表型解离特征,这与 实际临床工作中MG患者体内抗AChR抗体水平高 低和症状严重度不一致的现象有相似之处。 R77-96诱导的EAMG与人MG有相似的抗体特征。本实验首次使用R77-96作为抗原免疫小鼠,通过分析比较评估免疫后小鼠的运动障碍和病理表 现,成功建立EAMG小鼠模型。此模型有免疫应答 快、肌无力症状发作早的现象,有望为MG实验研究 提供一个更早的窗口期。由于目前有关R77-96溶 解性和免疫原性的相关研究成果较少,我们计划进 一步扩大实验小鼠数量,增设观察时间点,验证 R77-96诱导EAMG更快应答、更早出现肌无力症状 的现象。
