从海量数据中捕捉“幽灵”信号
研究的起点是一个庞大的单细胞转录组图谱，包含了来自新生犊牛与成年奶牛共十个不同胃肠道部位的近19万个高质量细胞。在常规分析中，大量测序读数会被比对到宿主基因组，但团队采用了名为SAHMI（单细胞宿主-微生物互作分析） 的前沿生物信息学方法。这套流程能严格区分真正的微生物信号与来自环境或试剂的污染背景噪音。
分析结果令人惊讶：在所有测序读数中，有20.5%成功比对到了已知的微生物参考基因组。这意味着，即便经过严格的数据清洗，仍有大量读数指向了存在于细胞内部的微生物RNA。这些携带微生物信号的细胞遍布所有检测的组织类型，其中皱胃（abomasum）组织中检测到信号的细胞比例最高。
特定细胞类型的“菌群偏好”
进一步细分到细胞类型，故事变得更加具体。在众多细胞中，潘氏细胞（Paneth cells）——小肠中负责分泌抗菌肽的特殊上皮细胞——显示出最高比例的微生物信号。相反，以快速吞噬降解细菌著称的中性粒细胞，其信号比例最低。这种分布差异暗示，微生物并非均匀地存在于所有细胞中，某些细胞类型可能为特定的内共生关系提供了更适宜的“微环境”。
研究团队接着定义了一类“微生物相关基因”，即那些在“有菌”细胞与“无菌”细胞之间表达存在显著差异的基因。在潘氏细胞和中性粒细胞中，这类基因与细胞本身的“身份标识”基因（标记基因）重合度最高。其中，一个名为CHCHD10的线粒体功能相关基因，在七种不同细胞类型中都出现了这种重叠，提示细胞内微生物的活动可能与宿主细胞的能量代谢存在广泛关联。
连接微生物与瘤胃发育的关键
研究的核心问题在于：这些细胞内的微生物信号，对奶牛至关重要的瘤胃发育有何影响？团队将焦点对准了新生犊牛的瘤胃组织。
他们发现，在瘤胃的多种上皮细胞中，基底细胞（Basal cells） 尤为特殊。大量与微生物信号相关的基因，同时也是在犊牛与成年牛瘤胃比较中差异表达的基因。这些基因主要富集在核苷酸切除修复、DNA复制和细胞周期等通路中。换言之，在携带微生物信号的犊牛基底细胞内，与细胞增殖、DNA维护相关的活动更为活跃。
更有趣的是，在新生犊牛瘤胃的基底细胞内，研究人员锁定了三种贡献了主要读数的细菌：Aliiroseovarius crassostreae、Enterobacter sp. T2 和 Euzebya pacifica。生物信息学注释显示，这些细菌的基因涉及蛋白合成、NADH脱氢酶（呼吸链关键组分）以及DNA复制辅助蛋白等功能。
眼见为实：荧光下的细胞内定位
生物信息学的发现需要实验验证。团队采用高灵敏度的细菌荧光原位杂交（FISH）技术，对新生犊牛和成年奶牛的瘤胃组织切片进行了观察。
结果清晰地显示：针对上述三种细菌设计的特异性探针，在新生犊牛的瘤胃上皮细胞内发出了红色荧光信号，而这些信号在成年牛样本中并未检测到。高分辨率图像进一步证实，这些荧光信号点状分布于上皮细胞的细胞质甚至细胞核区域。这为“细胞内存在微生物”提供了直接的形态学证据。
重塑对宿主-微生物互作的认知
这项研究首次为反刍动物胃肠道细胞内存在功能性微生物群落提供了多层次的证据链。它挑战了“胎儿肠道无菌”的传统观点，并提出了一个新颖的机制假说：在生命早期，特定的先驱微生物可能进入胃肠道上皮细胞内部，通过影响宿主细胞DNA复制与细胞周期等核心过程，参与调控瘤胃这一关键器官的发育与成熟。
当然，这些细胞内细菌的具体来源（是垂直传播来自母体，还是出生时即刻定植）、它们与宿主细胞确切的分子对话机制、以及其对奶牛长期营养代谢和生产性能的影响，仍是未来需要探索的重要科学问题。这项工作无疑为理解大型经济动物的发育生物学和宿主-微生物共生关系打开了一扇新的大门。
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